基因工程的基本条件.pptVIP

考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外 源基因的转录 提取出来的单链DNA重组分子 在噬菌体RNA聚合酶的存 在下，又可实现外源基因 的体外转录 人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百 甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳 定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外 源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 人造染色体载体 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 BAC载体能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100 kb以上的DNA片段。 ◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb(图9－7)，仅带有自我复制、控制拷贝数(repE)及质粒分配(par E，par A, par B )所必须的最少序列。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子位点，用于制备RNA分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段。 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 穿梭载体(shuttle vectors )是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(Autonomously replicating sequence, ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。 ◆ Ti质粒是一种细菌质粒(图9－9 )，它自然存在于一种革兰氏阴菌——土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤(grown gall tumors)。 ◆根瘤细胞的形成是因为土壤农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞(tumor- inducing,Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒。Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA(transfer DNA,T-DNA)，当T-DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine),作为土壤农杆菌的碳源和氮源 Ti质粒具有五个主要功能区域(图9－9)，它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmid transfer)、冠瘿碱代谢(opine catabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。 T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-