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基因组DNA提取与PCR技术 李兆阳 前言 在基因工程和蛋白质工程中，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。 主要内容 基因组DNA提取 1、核酸的分类及理化性质 2、几种核酸提取方法的基本原理及实 例分析 3、常见问题与对策 核酸分为两大类 脱氧核糖核酸（DNA） Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid。 脱氧核糖核酸（DNA） DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大 DNA结构 核糖核酸（RNA） RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。 核酸的理化性质 RNA核苷酸的纯品呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 核酸的理化性质 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 核酸的理化性质 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时， 常用此法分离这两种核蛋白。 DNA提取的几种方法 (1).浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化钠提取液抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积无水乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. 也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异戊醇法除去蛋白. 　　两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. （2）阴离子去污剂法 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸 基因组DNA-SDS法 以动物组织为例 （3）苯酚氯仿抽提法 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 . （4）水抽提法: 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积无水乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用70%、80%和95%乙醇洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品. 几种方法的比较苯酚、氯仿抽提/醇沉淀方法 是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便 。苯酚、氯仿抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。 关键 ：酚氯仿要混匀彻底，用量足够。 浓盐法 高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与酚氯仿抽提方法相比，纯度的稳定性可能要低一点。 更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提。 不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。 水沉淀 此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用. 实例分析 从鼠尾组织中提取基因组DNA DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA电泳图 PCR技术 1、PCR发展历史 2、PCR原理及引物设计基本原则 3、常见问题与注意事项 4、PCR技术的发展 PCR发展历史 PCR的设想 本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过