细胞培养技术-上交大《医学实验技术》精品课.pptVIP

细胞培养技术  cell culture 上海交通大学医学院 刘湘帆讲师 细胞培养技术 从生物体内取出组织或细胞，在体外(in vitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究，这种方法就是细胞培养（cell culture）。有时细胞培养也称为组织培养（tissue culture），二者可作为同义语使用。 细胞培养的工作始于20世纪初目前广泛应用于生物学、医学的各个领域，并且是各种细胞工程技术的基础。哈里森（ Harrison，1907），因此被称为“组织培养之父” 一、基础理论 （一）培养细胞的类型及其特点 体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。 （1）贴附型 大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。 培养细胞的类型及其特点 贴附细胞型MRC-5成纤维细胞 培养细胞的类型及其特点 贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞 正常贴附型细胞的特点 接触抑制：正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长。 密度抑制：细胞生长、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。 肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。 (2) 悬浮型 少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。 细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。 其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。 （二）培养细胞的增殖过程 培养细胞的生命期 培养细胞的生命期（life span）指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。从体内取出细胞接种培养到第一次传代叫原代培养，一般持续1-4周。 原代细胞一经传代后便称为细胞系（cell line），进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体的核型。一般情况下可传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。 肿瘤细胞系可无限增殖而无衰退期，正常细胞系也可在传代期末期或衰退期发生自发转化，细胞获得永生性即永久增殖的能力，称为无限细胞系或连续细胞系。 3、培养细胞一代的增殖过程 培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间相对孤立，营养是有限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（passage 或subculture）。 从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代。需要注意的是细胞培养一代与细胞倍增（doubling）的概念是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，细胞可倍增2-6次。 细胞传一代以后，细胞群体一般要经过潜伏期、指数增长期与平台期三个阶段。 以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种后呈悬浮状态，在0．5-4 h内贴附于支持物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生，原代细胞持续约24-96 h，而肿瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24 h。 随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细胞群体进入指数增长期，此期又称对数期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适于进行实验研究；此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，一般可持续3-5天。 随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液后即可迅速进入指数增长期。 3. 培养细胞的生存条件 培养细胞需要特定的培养基和培养设备。培养细胞在培养器皿中生长，浸浴于培养液，并需要特有的环境，包括一定的温度、湿度和气体成分。 （1）培养基 培养细胞所需营养物质与体内细胞相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等。细胞在体外生存于含各种营养成分的培