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详细解读CAR-T细胞治疗通用生产规程

嵌合性抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)免疫治疗在多种血液病和实体瘤中研究，对B细胞恶性肿瘤具有显著疗效。从病人外周血中提取T细胞，进行加工，使其表达嵌合性抗原受体，再现对肿瘤细胞的杀伤作用。随着后期临床试验的到来，CAR-T细胞疗法为更多病人的提供了选择方向，伴随而来的，CAR-T细胞的通用生产要求则成为广泛性讨论的话题。并且，从单个研究机构到大规模多点生产中心制造CAR-T的挑战必须得以解决。在CA19嵌合性抗原T细胞疗法----CTL019这个基础上，已经预料到这样的问题。在本文中，我们将讨论细胞生产过程涉及的技术步骤，包括细胞生产中最佳的使用载量，以及解决嵌合抗原受体T细胞治疗全球病人面临的挑战。

CAR-T细胞治疗是一种使病人T细胞重新带有特异性靶抗原和杀死肿瘤细胞能力的细胞疗法。CARs在基因水平上涉及融合蛋白，包括（1）来自单克隆抗体的抗原识别区域；（2）胞内区T细胞信号和共刺激分子。CAR-T作为癌症的治疗，已经广泛地应用在B细胞恶性肿瘤病人中，早期的结果令人鼓舞。例如，在I期临床，CAR-T细胞疗法在儿科病人、复发或难治性急性淋巴细胞白血病中表现出69%-90%的完全缓解率。CAR-T细胞治疗的进展现已扩展到第1阶段试验，并进入第2阶段多点试验，科研单位和企业主要的考虑的是如何使CART细胞生产规模化。这里，我们描述了CAR-T细胞生产的过程，并且讨论监管问题，必须解决如何成功地生产大量患者所需求的CAR-T细胞。

一、CAR-T细胞的生产

CAR-T细胞的生产需要几个详细的步骤，质量控制检测贯穿于整个过程。首先，该方法从患者体内的外周血中分离白细胞，并将其他成分返回血液循环。当白细胞收集足够后，用白细胞分离产品对T细胞进行富集（图1）。淋巴细胞的富集可以通过密度梯度离心法完成，此法根据细胞的大小和密度分离，并保持细胞活力。T细胞亚群的分离通过CD4/CD8特异性抗体或者表面标记偶联磁珠进行分离。更加高效地激活T细胞，可利用CD3/CD28单克隆抗体磁珠或者人工刺激的APCs（aAPCs），这些方法的使用比以前的单独抗CD3抗体或联合IL-2效果更好。在选择刺激源时同时也可以考虑将T细胞在扩增中极化为特异性表型（例如Th2或Th17）。T细胞激活后，转染编码CAR的病毒载体。病毒载体利用病毒机制连接至病人细胞，进入细胞内后，载体已RNA的形式将基因转导。在CAR-T细胞细胞中，此基因编码CAR。RNA反转录成DNA，并永久地整合到病人细胞的基因组；因此，CAR可以在细胞分裂是得以表达，并且在生物反应器中也可以扩增。CAR通过病人细胞进行转录和翻译，且表达于细胞表面。目前，基因整合方式包括有慢病毒、γ逆转录病毒、睡美人转座子系统或mRNA转染、mRNA电转，相对而言，慢病毒有不可替代的优势。生物反应器培养系统的设计，提供最佳的气体交换的要求和细胞扩增所需，满足临床的使用（图2）。目前用于CAR-T细胞培养的生物反应器或系统主要有Wave反应器、G-Rex及CliniMACSProdigy。综合实际情况考虑，CliniMACSProdigy可以完成细胞的制备，富集，刺激，转导，扩增，最终收集和采样，是最适合用于临床试验中T细胞的制备。当细胞扩增完成，细胞培养体积至5L，必须将细胞浓缩至一定体积回输给病人。将清洗和浓缩的细胞冻存起来，接着经过产品放行，冻存细胞运输至目的地再解冻回输给病人。

图1、2细胞培养和转导

二、CAR-T细胞运用与全球病人的挑战

虽然临床级别的CAR-T细胞生产的操作规程已经建立，但是用于治疗的CAR-T疗法只限于很少的一部分病人。如果要应用于更多临床实验、更多病人，这个生产规程则应该更好地进行评估，以保证产品的有效性。因为CAR-T细胞仅能用于靶向的癌症，所以载体及CAR-T细胞的生产规模也依赖于指征的影响。其他原因还有，修饰细胞的载体，基因治疗的长期安全性以及合适的全球监管措施。

三、细胞处理的一致性：最佳载体的使用

在美国和欧盟，转染CAR的病毒载体是CAR-T细胞生产过程的关键性原料，修饰后T细胞被认为是临床实验的最终产品。编码CAR的病毒载体可以大规模生成，低温条件下可长期保存。由于终产品CAR-T细胞无法通过过滤来达到无菌，故载体的生产必须在GMP条件下进行，无菌相当重要。以保证最终载体产品和细胞的无菌。批量制造细胞疗法的病毒载体至少需要2周，首先培养足够数量的细胞，如HEK293T细胞，用于质粒转染，转染质粒通常是（1）GAG/聚合酶包装结构；（2）异种来源编码的包膜糖蛋白；（3）表达病毒辅助蛋白的结构Rev；（4）编码CAR的载体质粒构造以及高效反转录、RNA包装与整合所需的其他序列。载体系统应该采用一些关键的安全特性，全面防止复制