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第四组:考马斯亮蓝法

-第一部分实验原理第二部分操作步骤第三部分考马斯亮蓝染色法的优缺点是第四部分考马斯亮蓝法有公式吗？第五部分实验中注意事项

1实验原理

实验原理考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定考马斯亮蓝G—250分子结构式

实验原理

2操作步骤

操作步骤(一)试剂配制1、考马斯亮蓝G250溶液配制准确称取0.1g考马斯亮蓝G250，溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%磷酸，最后用蒸馏水稀释定容1000mL备注：考马斯亮蓝G250溶液的用量100mL足够

操作步骤2、牛血清蛋白溶液配制准确称取50mg牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容到500mL，配制成浓度为100μg/mL的牛血清蛋白原液(二)标准曲线的制作1、取5-7支试管，分别准确配制不同浓度梯度的牛血清蛋白溶液(浓度控制在10~100μg/mL范围内)1mL，具体操作：取100-900μL牛血清蛋白原液，水补足到1mL，浓度相当于所取原液量的十分之一2、在不同浓度的1mL牛血清蛋白溶液中，分别加入5mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，置于25℃水浴保温10min

操作步骤3、以1mL蒸馏水加5mL考马斯亮蓝溶液为空白对照，冷却后测定波长595nm处的吸光值4、以配制的标准蛋白浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标制作标准曲线，并做线性回归分析，求线性方程(三)目标样品的蛋白浓度测定取目标蛋白样品按标准曲线方法测定。依据线性方程计算目标样品的蛋白质浓度

3考马斯亮蓝染色法的优缺点是

考马斯亮蓝染色法的优缺点是

4考马斯亮蓝法有公式吗？

考马斯亮蓝法有公式吗？依据朗伯-比尔定律，在一定浓度范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的吸光度与蛋白质含量呈线性关系,其关系式为:A=kbC复合物，式中,A为吸光度,k为摩尔吸光系数,b为吸收层厚度,Cus物为考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的浓度

如下图表格所示,取8支干净试管,并编号0-7

其中0号试管作为空白对照

1-6号试管按下表配方依次添加各种试剂,包括不同浓度的标准蛋白溶液

7号试管装有未知蛋白液样品

按比例混匀后,室温静置3min,于波长595nm处测得8支试管的吸光度值

取0-6号试管的吸光度值,以吸光度为纵坐标,各标准蛋白液浓度(ug/ml)为横坐标作图,绘制标准曲线

再根据标准曲线计算出考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的摩尔吸光系数k=A/bC复合物

考马斯亮蓝法有公式吗？最后将7号试管中未知蛋白液的吸光度代入公式C复合物=A/kb，即得求得蛋白质浓度该实验中,0号试管中没有加入任何蛋白液,作为空白组,理论上吸光度值为零,而实际测量中,由于溶液中残留的蛋白质、吸收池以及仪器的系统误差影响等,即使不加蛋白液,也存在着一定的可见光吸收,与朗伯-比尔定律计算公式A=kbC合物的理论值不一致，从而造成标准曲线的绘制误差

5实验中注意事项

实验中注意事项1.样品的处理：在进行考马斯亮蓝法测定前，需要对样品进行预处理，如去除杂质、调整样品的pH值等。这样可以避免杂质对测定结果的影响，提高测定的准确性2.染色剂的选择：考马斯亮蓝法中，亮蓝染料是关键的试剂，选择合适的染料对于测定结果的准确性至关重要。常用的染料有考马斯亮蓝G-250，选择适合样品的染料可以提高测定的精确度3.反应时间的控制：考马斯亮蓝法中，样品与染料的反应时间对测定结果有一定影响。反应时间过长可能导致染料的漂白或分解，从而影响结果的准确性；反应时间过短则可能导致复合物的形成不完全，同样会影响结果的准确性。因此，需要根据样品的特性和染料的性质，进行合理的反应时间控制4.光谱测量条件的选择：在进行测量时，需要选择合适的光谱测量条件，如选择适当的波长进行测量，以及调整光程等。这样可以提高测定的准确性和重复性

实验中注意事项5.数据处理与结果分析：在测定完成后，需要对测得的数据进行处理和分析。常用的方法有标准曲线法、比色法等。通过合理的数据处理和结果分析，可以得到准确的蛋白质含量测定