第3章 DNA的复制课件.pptVIP

第三章DNA的复制;遗传信息传递的中心法则

;目录;DNA体内复制：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链）、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒（双链，环状）

DNA的体外复制：分子克隆。;DNA的复制;DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semiconservativereplication)。;DNA的半保留复制可以说明DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。;DNA的半保留复制实验依据;第3章DNA的复制;复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图

(Cairns实验);第3章DNA的复制;原核生物DNA聚合反应有关的酶类

;大肠杆菌的引物酶也是DNA复制所必需的一种酶。该酶由一条多肽链组成，MW为60KD，每个细胞中有50-100个分子由大肠杆菌的dnaG基因编码。引物酶催化引物RNA分子的合成，但它和传统的RNA聚合酶不一样。[1]引物酶对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感;[2]引物酶既可以利用核糖核苷酸，而RNA聚合酶只能利用核糖核苷酸;[3]引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA从而将遗传信息由DNA传递到RNA。但在单链噬菌体M13DNA和质粒Co1E1DNA复制时，引物的合成是由RNA聚合酶催化的。噬菌体T7的Gene4蛋白，T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似的功能。;DNA在细胞内往往以超螺旋状态存在，DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。DNA拓扑异构酶有两类，大肠杆菌的ε蛋白(MW-110000)就是一种典型的拓扑异构酶Ⅰ.它的作用是暂时切断一条DNA链，形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛化，然后再将切断的单链DNA连接起来，而不需要任何辅助因子。而大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNAgyrase)则是典型的拓扑异构酶Ⅱ，能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解为ADP以供能。;单链DNA结合蛋白(SSBP);螺旋酶（helicase）可以促使DNA在复制叉处打开双链。螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与ATP结合，利用ATP分解成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。目前，大肠杆菌中发现有两种螺旋酶参与这个过程，一种称为螺旋酶Ⅱ或螺旋酶Ⅲ，与前导链的模板DNA结合沿5→3方向运动;第二种称为Rep蛋白，和前导链的模板DNA结合沿3→5方向运动。;DNA聚合酶催化的链延长反应;DNA聚合酶(DNAPolymerase);大肠杆菌三种DNA聚合酶比较;大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ);大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ);(3)该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2－脱氧核苷酸掺入到DNA链中。

(4)该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。;大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ;[1]聚合作用

在引物RNA3-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生变化，促进3-OH与5-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不能与模板配对，无法改变酶的构象而被3-5外切酶活性位点所识别并切除之。;[2]3→5外切酶活性──校对作用

这种酶活性的主要功能是从3→5方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。;第3章DNA的复制;[3]5→3外切酶活性──切除修复作用

从5’→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5’-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5→3外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。;[4]焦磷酸解作用

DNApolⅠ的这种活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板D