膜片钳技术(研究生平台课).ppt

膜片钳技术讲座 哈尔滨医科大学生理学教研室 李玉荣 在膜片钳技术及应用一书的序言中写道： 通常，一篇非常专业的科技论文公开发表后，若被其他的论文引用数次，其作者就会感到欣慰；假如被别的作者引用十次以上，就可称得上是一篇好论文；要是有幸被引用几十上百次，甚至几百次，那它无疑是一篇高质量杰作，通常发表在权威的专业期刊或者是著名的科学杂志上，如“Nature” ，“ Science”， “ Cell”和“ Neuron”等。 然而，你是否知道？有一篇论文，它的作者当时还不太有名，刊登的杂志也不算顶级，可是论文发表20年来，已神话般地被世界各地的科技工作者引用了一万二千余次，遍及生物医学的众多领域，而且近年来还在以平均每年约一千多篇的速度继续被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年发表在《欧洲生理学杂志》（Pflugers Archiv.）上的著名论文Improved Path-Clamp Technigues for High-Resolution Current Recording from Cells and Cell-free Membrane Patches。在此之前五年，身为德国科学家的Neher和Sakmann共同发明了膜片钳技术（1976），并于15年后共同荣获1991年诺贝尔 生理学或医学奖。膜片钳技术的作用和影响由此可见一斑。 生物电现象研究简史 18世纪末，意大利医生和生理学家Galvani首先在生物体(蛙)发现了生物电现象。 1902年，Bernstein提出了细胞生物电产生的膜学说。 1936年，英国剑桥Young描述了头足软体动物枪乌贼支配其外套膜肌的巨大轴突直径可达1mm。 1939年，Hodgkin和Huxley 把枪乌贼巨轴突用于细胞内膜电位的记录，首次记录到膜两侧的静息电位。这一工作的意义在于实验测定的静息电位与根据细胞膜内外钾浓度经Nernst公式计算的钾平衡电位非常接近，从而有力地支持了Bernstein关于静息状态下细胞膜对钾离子有选择性通透的膜学说。 1955年，Hodgkin和Keens在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现，放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄孔洞的运动，并提出了“通道”（channel）的概念。 细胞膜对离子通道的通透性（膜电导）的直接测定是从应用电压钳（voltage clamp）技术以后开始的。 电压钳技术是1949年Cole及Marmont设计的，后经Hodgkin、Huxley 和Katz等加以改进，并成功地应用于枪乌贼巨轴突动作电位期间离子电流的研究。 他们直接测定了膜电流并分析了电流的离子成分，推算出动作电位期间钠电导和钾电导的变化。极大的推动离子通道的研究工作，其中的基本概念至今仍被沿用。鉴于Hodgkin、Huxley 和Eccles 对通道研究的突出贡献，获得1963年诺贝尔医学或生理学奖。 1972年Katz通过记录神经肌接头终板膜上乙酰胆碱噪声，发现ACh的量子性释放引起的终板电位及微终板电位，指出其与离子通道的电导、开放时间及开放频率的对应关系，获1970年诺贝尔生理学或医学奖。 1976年Neher和Sakmann完成电极与膜之间50MΩ的封接，首次记录到去神经蛙肌纤维膜上的单通道电流，为证实生物膜离子单通道是以全或无规律、随机开放关闭的假说提供了有力依据。 1980年，Neher等利用负压吸引实现了GΩ封接，背景噪声显著减低。 1991年膜片钳技术的创始人Neher和Sakmann荣获诺贝尔医学或生理学奖。 一、离子通道的概念 二、离子通道的分子结构 三、离子通道的分类 四、离子通道的研究技术 五、膜片钳实验方法 六、与膜片钳技术相结合的其它研究 方法 一、离子通道的概念 离子通道（ion channels）是细胞上的 一种特殊整合蛋白， 在脂质双分子层膜上 构成具有高度选择性 的亲水性孔道，允许 适当大小和电荷的离 子以被动转运的方式 通过。 离子通道是生命活动的基础，无论动物或植物、单细胞生物或多细胞生物的细胞膜上，都有离子通道存在。 离子通道的最基本功能是产生细胞生物电现象，即与细胞的兴奋性直接相关。在此基础上，才进一步派生出神经递质的释放、腺体的分泌、肌肉的运动。因此，离子通道是可兴奋细胞膜上的基本兴奋单元，具有重要的生理功能。 离子通道具有两大共同特征，即离子选择性及门控特性。前者包括通道对离子大小的选择性及电荷选择性，在一定条件下，某一种离子只能通过与其相应的