细胞工程原理与技术-实验计划.doc

《》吕新怀xhlv@mail.ustc.edu.cn, 3600453 实验　细胞的培养、传代、复苏和冻存1、HL-60细胞的培养与传代 1.1　实验分组 　　 83_人分3大组进入万级净化细胞间，每大组 27，27，29 人，分 9 个小组，每小组 3 人，实验材料准备及实验操作以小组为单位。 1.2　实验材料 　　HL-60细胞，无菌完全RPMI-1640培养液，无菌离心管吸管离心机2培养箱等。 1.3　实验方法 HL-60细胞为悬浮细胞生长的细胞，可在完全RPMI-1640培养液中培养，该培养液由90％不完全1640培养液RPMI-1640液95毫升0.1M丙酮酸钠1毫升0.2M谷氨酰胺　　　　　　　　　　　　 1毫升1M　Hepes 1毫升7.5％ NaHCO３1毫升青霉素、链霉素(各1万单位) 1毫升灭活胎牛或新生牛血清×5min, 然后去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。根据细胞数量，可采用1瓶传3瓶或其它比例传代。 2 HL-60细胞的冻存 2.1 原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130以下的低温中能减少冰晶的形成。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管）、离心管、吸管、离心机等试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4下保存。 对于无血清培养基，一些普通的培养基成分可能是： 　 *50％细胞条件无血清培养基和50％包含有7.5％二甲基亚砜的新鲜无血清培养基或 *包含有7.5％二甲基亚砜和10％细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。 2.3 方法与步骤 2.3.1 消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。1000 rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。将悬液分至冻存管中，每管1ml。将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。按下列顺序降温：室温→ 4（20分钟→ 冰箱冷冻室（30分钟）→ 低温冰箱（－30 1小时）→ 气态氮（30分钟）→ 液氮。操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0，细胞仍能生长，活力受损不大。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。 1 主要工作原理 当单个细胞通过一个聚光束时，系统会测定几个参数。这些参数是通过测量细胞的荧光和它们散射光的主要方式确定。计算机给所有数据分类并绘图。 1.1 其流动装置的主要原理是：标本样品被制成单细胞悬液，经染色进入流动室，流动室里充满鞘液。由于鞘液压力与样品流压力不同，当二者差异达到一定程度时，鞘液会裹挟着样品流中的细胞排成单列逐个通过激光聚焦区。 1.2 光学部分的原理:光照到细胞上，会发生散射。散射光分为前射光和侧散射光。如果散射光方向与入射光相同，叫前散射光：成900方向散射，叫侧散射光。激光由聚焦镜聚焦照到细胞流上，前散射光由光电二极管接收。侧散射光和激发荧光由荧光收集透镜收集，再经一个二向色性反射镜和过滤器分离。反射镜分为SP和LP。SP允许短波通过，反射长波的光。短波光由FL1光电倍增管接收，同时也分离出10%左右的侧散射光。长波光照到LP上，又分离出稍长波长的光，由FL3光电倍增管接收；同时，稍短一线波长的光被反射，有FL2光电倍增管接收。 总而言之，光照到细胞上，光电倍增管将光信号转换成电信号。再由放大器把信号放大，再由模/数转换器将电信号变成数字信号，在计算机上显示出来。流式的应用