分子生物学实验原理与常见问题解答.ppt

宁夏疾控中心病毒科 马江涛 RNA提取原理与注意事项 商品化提取试剂盒原理： 异硫氰酸胍（GIT）-酚法 GIT与 十二烷基肌氨酸钠 （Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA； GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一定条件下（各家试剂条件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白质溶于乙醇溶液，通过滤柱时，RNA挂柱， DNA和蛋白质溶于滤液；在逐步洗脱的过程中，RNA不断被纯化；最后用水洗脱。 杜绝外源酶的污染： 严格戴好帽子，口罩，手套。 实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 阻止内源酶的活性： 选择合适的匀浆方法。 选择合适的裂解液。 控制好样品的起始量。 RNA提取原理与注意事项 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 标准的PCR反应体系（100ul体系） 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10～100pmol 模板 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素 模板 （template） 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） Mg2+ （magnesium） EB染色原理：EB插入DNA碱基对之间的结合 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 无扩增产物 假阳性 PCR中应注意的事项 （一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 Real-time PCR技术介绍 常用的荧光基团 由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件： ①探针长度应在20～40个碱基左右，保证结合特异性。 ②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。 ③避免与引物发生杂交或重叠。 ④探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。 另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。 特 点 　　FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。 real-time PCR中应注意的事项 （一）保持反应管的清洁 管盖上严禁写字 不能徒手拿取 反应结束后严禁打开 （二）设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 靶序列或扩增产物 的交叉污染 原因 开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外 更换试剂、耗材 试剂分装，贮存适当。 更换实验室和所有试剂耗材。 　现象：空白对照出现目的扩增产物 对策 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团