压应力对骨髓间充质干细胞成骨分化早期阶段成骨和破骨生成能力的 ....docVIP

附件2 论文中英文摘要 作者姓名：刘钧 论文题目：压应力对骨髓间充质干细胞成骨分化早期阶段成骨和破骨生成能力的影响 作者简介：刘钧，男，1981年8月出生，2005年09月师从于四川大学赵志河教授，于2008年6月获博士学位。 中 文 摘 要 一、研究背景和目的 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是目前公认的生成组织工程化肌腱、血管、骨等组织最有前途的种子细胞之一。有学者发现牙周膜细胞有诱导MSCs呈现典型的牙周膜细胞的特点，提示MSCs很可能是牙周膜细胞的前体细胞，在牙周组织修复和再生中有良好的临床应用前景。牙周组织重建作为正畸牙移动的生物学基础，其机制涉及到错综复杂的生理和病理组织改变，MSCs很可能在该过程中发挥关键性作用。应力作为正畸医师的“药”，其对正畸牙移动过程中的骨重建作用是不容置疑的。正畸力作用下MSCs能分化为成骨细胞，并同时诱导生成破骨细胞，分别进行牙槽骨的沉积与吸收，实现牙周骨组织的重建。因此，以MSCs为研究对象是进一步探索正畸牙移动机制的必由途径。以往大多数生物力学研究集中关注成骨分化晚期的力学刺激效应机制，但应力是如何调控MSCs向成骨细胞早期分化并同时影响破骨细胞的诱导生成，目前尚未见报道。研究这一问题对于进一步阐明正畸牙牙周对矫治力的生物学反应机制至关重要。 目前，已有众多学者致力于以骨组织工程为代表的干细胞力学生物学研究，前期研究已显示了力学刺激应用于干细胞骨组织重建修复的优势，但相关力学作用机制研究尚较缺乏，这无疑制约着力学生物学在该领域的进一步有效应用。因此深入研究应力对MSCs成骨分化的调控及其机制，尤其是成骨分化的早期启动阶段，可能将会给干细胞骨组织重建修复提供新的思路。 本研究从细胞和分子水平上观察检测动态与静态压应力刺激对大鼠骨髓MSCs成骨诱导分化早期阶段成骨和破骨生成能力的影响。研究分为三个部分：压应力对骨髓MSCs成骨分化早期阶段成骨生成能力的影响；压应力对骨髓MSCs成骨分化早期阶段促成骨生成的力学信号通路（ERK/p38 MAPK）研究；压应力对骨髓MSCs成骨分化早期阶段破骨诱导生成能力的影响。 二、研究方法 采用贴壁法分离培养大鼠骨髓MSCs（2～3周龄Sprague-Dawley雄性大鼠，约80～100?g）。根据细胞表面抗原、成脂与成骨分化检测对MSCs进行鉴定，成骨诱导剂（OS）采用0.05?mmol/L AsAp、10?mmol/L β-GP、10-8?mol/L Dex。根据前期预实验MSCs成骨诱导检测碱性磷酸酶ALP比活性，选定MSCs成骨诱导0、3和7天三个时间点代表其成骨分化早期阶段三个分化时间点。取生长良好的2～4代MSCs以2×104/cm2接种，亚融合后分别成骨诱导3天和7天。然后将OS培养液换为普通培养液，使用本课题组与四川大学生物力学实验室合作研制的细胞压应力数控加载系统对大鼠骨髓MSCs分化早期阶段（0、3、7天）分别施加动态压应力（10～36?kPa，0.25?Hz）和静态压应力（23?kPa）刺激，加力时间每天1小时，持续1、3、5天。动、静态压应力数控加载由基于Boland C++ Build 5开发平台自行设计的加载控制软件实现。 从细胞和分子水平上观察检测动态（10～36?kPa，0.25?Hz）与静态（23?kPa）压应力刺激对大鼠骨髓MSCs成骨诱导分化早期阶段的影响。采用MTT法检测增殖活力，酶比活力定量检测ALPase表达，荧光实时定量（Real-Time）RT-PCR技术检测成骨分化关键调控因子Runx2与Osx的基因表达、破骨诱导关键性决定因子RANKL与OPG的基因表达。并将加力后的成骨分化早期阶段MSCs与单核细胞株（RAW264.7）进行共培养，培养液中加入破骨诱导分化剂Dex（10-7?mol/L）和1,25(OH)2?VitD3（10-8?mol/L），48小时半换液一次，共培养9天，重酒石酸盐抗酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒染色观察其破骨诱导生成能力的变化。 本课题组还进一步研究了压应力对骨髓MSCs成骨分化早期阶段促成骨生成的MAPK力学信号通路（ERK/p38 MAPK）参与情况，采用Western Blot方法检测了ERK与p38 MAPK蛋白的表达。根据参考文献和本实验前期浓度梯度实验确定ERK1/2信号通路特异性阻断剂PD98059作用终浓度为10?μmol/L，该浓度PD98059能有效抑制ERK1/2磷酸化，并且PD98059加入后对细胞生长无明显影响，细胞脱落凋亡现象很少。研究添加ERK通路抑制剂PD98059对力学诱导作用的影响。 三、研究结果 动、静压应力对MSCs早期成骨分化增殖活力基本无影响，除了未诱导MSCs（OS，0天）加载静压力5天